Summary

GEREÇ VE YÖNTEM
Çalışma grubumuz 60 KHAK hastası ve 20 sağlıklı bireyden oluşturuldu. Serum düzeyleri ‘enzyme-linked immunosorbent assay' (ELISA) ile ölçüldü.

BULGULAR
VEGF (p<0.001) ve reseptörleri (p<0.001) kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bulundu.

SONUÇ
Elde edilen veriler doğrultusunda anjiyogenik faktörlerin hastaya uygulanacak antianjiyogenik tedavinin kararının verilmesinde kullanılabileceği görüşüne varılmıştır.

Introduction

Tümör anjiogenezi ise tümör büyümesi, metastazın saptanması ve izlenmesinde önemlidir.

1-2 mm’den küçük tümörler çevre dokudan beslenebilirlerken, daha büyük tümörler beslenemez ve bu nedenle yeni kapiller ağı oluştururlar. Tümör, daha sonra farklı başka faktörlerin de etkisi ile çevre dokuya ve/veya yakınındaki damar içine geçerek dolaşımla uzak dokuya giderek yerleşir.

Tümörden salgılanan ve anjiogenezi uyardığı düşünülen faktörler arasında fibroblast büyüme faktörü (FGF), platelet kökenli büyüme faktörü (PDGF), transforme edici büyüme faktörü (TGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve vasküler endotelial büyüme faktörü (VEGF) sayılabilir.[2]

Endotel hücreleri üzerinde etkili olan bu önemli büyüme faktörlerinden biri de vasküler endotelial growth faktör (VEGF) dür. Endotelial hücre çoğalmasını ve anjiogenezi uyaran, damarlanmayı düzenleyen VEGF, 45 kDaltonluk heparin bağlayıcı glikoprotein yapısında bir moleküldür; vasküler permeabiliteyi arttırıcı, hücre migrasyonu ile apoptozisi uyarıcı özellikleri bilinmektedir. VEGF reseptörleri üç tiptir. Reseptörlerin genel özellikleri, Ig G benzeri ekstrasellüler bölgeye sahip olmaları ve tirozin kinaz aktivitesi göstermeleridir. VEGFR-1 (fms-related tyrosine kinase/FLT-1) ve VEGFR-2 (kinase insert domain receptor/KDR) damar formasyonunda rol oynarlar. VEGFR-3 ise lenfatik çoğalma ile ilişkilidir.[3-6]

Çeşitli patolojik olaylarda önemli olan anjiogenez son yıllarda tümör tedavisinde de hedef olarak görülmektedir.[1,7] Özellikle hematojen yayılım gösteren kanser tiplerinde anjiogenez daha da önemli role sahiptir. Tümör anjiogenezi, hastalığın prognozuna, progresyonuna ve metastazın gelişmesine yol açan önemli bir olaydır. Bu nedenle son yıllarda tümör izlenmesi ve tedavi çalışmaları bu konuda yeni moleküllerin ve ilaçların gelişimine yönelmiştir.

Akciğer kanseri 50-80 yaş grubu arasında kanserden ölümlerde ilk sırayı alan bir tümör tipidir. Her yıl yeni kanser vakalarının %15’ini, tüm kanser ölümlerinin %18’ini oluşturmaktadır. Küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK) ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) olmak üzere iki büyük grup altında tedavi edilmektedir. Bu iki tip kanserin tedavi protokolleri birbirinden farklıdır.[8]

Bu çalışmadaki amacımız KHAK’li hastalarda VEGF ve reseptörlerinin tedavi öncesi ve sonrası serum düzeylerinin belirlemek, hastalığın tedavi takibinde kullanılabilecek yeni bir hedef olup, olamayacağını araştırmaktır.

Methods

Hastalara 3 haftada bir toplam 4 kür sisplatin (1. günde 75 mg/m²) ve etoposide (1.-3. günlerde 120 mg/ m2) uygulandı. Sınırlı evreli hastalara ayrıca radyoterapi (50.4 Gy) uygulandı.

Metabolik bozukluklar dışlama kriteri olarak alınmadı.

Hastalardan kemoterapi öncesi ve sonrasında alınan kanlardan ayrılan serumlar, gerekli test sayısı tamamlanıncaya kadar -20°C’de saklandı.

VEGF, VEGFR -1 ve VEGFR -2 (R&D Systems Inc. MN55413, U.S.A.) serum düzeyleri kantitatif sandviç immunoassay yöntemiyle belirlendi. Testlere özgü antikor kaplı mikrokuyucuklara standartlar ve örnekler pipetlendi. Antijenin bağlı antikorla bağlanması beklendikten sonra yıkama yapıldı. Yıkamadan sonra VEGF için özel enzime bağlı poliklonal antikor; VEGFR -1 ve VEGFR -2’ye özgü ayrı ayrı monoklonal antikorlar eklendi. 2. yıkama işleminden sonra substrat ilave edilmiş ve reaksiyonun tamamlanması beklendi. Reaksiyon durdurulduktan sonra oluşan renk yoğunluğuna bağlı olarak antijen miktarları spektrofotometrede (Rayto, RT-1904C Chemistry Analyzer) absorbans olarak okundu.

Her üç test için konsantrasyonları bilinen standartlar yardımıyla ayrı ayrı standart eğriler çizildi ve her bir örnekteki antijen konsantrasyonları bu standart eğriler yardımıyla ng/ml olarak hesaplandı.

İstatistiksel analizler SPSS versiyon 16 yazılımı kullanılarak yapıldı. Değişkenlerin normal dağılıma uygunluğu analitik yöntemlerle (Kolmogorov- Smirnov/Shapiro-Wilk testleri) incelendi. Tanımlayıcı analizler normal dağılmayan değişkenler için ortanca ve çeyreklerarası aralık kullanılarak verildi. Değişkenler gruplar arasında Mann- Whitney U testi kullanılarak karşılandı. p<0.05 olduğu durumlar istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar şeklinde değerlendirildi. En uygun sınır değer belirlenmesinde ROC eğrisi analizi yapıldı.

Rapor taslakları STARD grubunun kriterlerine göre oluşturuldu.[9]

Results

Tablo 1: Parametrelere ait aritmetik ortalama, standart sapma, ortanca, minimum ve maksimum değerleri

Kontrol grubunun (n=20) ortanca, minimum ve maksimum değerleri VEGF için 0.22 (0.09-1.6), VEGF-R1 için 0.02 (0.01-0.17), VEGF-R2 için 7.44 (0.4-15) olarak bulundu. Hasta grubunda tedavi öncesi VEGF, VEGF-R1 ve VEGF-R2 düzeyleri kontrol grubuna oranla ileri derecede yüksek (p<0.001) bulunurken, kemoterapi sonrası herhangi bir değişiklik gözlenmedi (VEGF: p=0.412; VEGF-R1: p=0.183; VEGF-R2: p=0.851).

Gruplara göre serum VEGF, VEGFR-1 ve VEGF-R2 düzeyleri şekilde gösterilmiştir (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3).

Sekil 1: Gruplara göre serum VEGF düzeyleri.

Sekil 2: Gruplara göre serum VEGFR-2 düzeyleri.

Sekil 3: Gruplara göre serum VEGFR-3 düzeyleri.

Çizilen ROC eğrisiyle belirlenen üst sınırlar VEGF için 0.84 ng/ml, VEGF-R1 için 0.03 ng/ml ve VEGF-R2 için 10.24 ng/ml’dir. Eğrinin altindaki alan (AUC) VEGF için %80.8 (%95 güvenilirlik aralığı: 69.1-92.4), VEGF-R1 için %86 (%95 güvenilirlik aralığı: 73.7-98.3) ve VEGF-R2 için %81.3 (%95 güvenilirlik aralığı: 69-93.6) olarak bulundu. Belirlenen üst sınır değerlerine göre özgüllük ve duyarlılıklar VEGF için %75 ve %71.8, VEGF-R1 için %75 ve %89.7, VEGF-R2 için %75 ve %64.1 olarak bulundu (Şekil 4).

Sekil 4: Gruplara göre çizilen ROC eğrisi.

Discussion

Otuz sekiz benign akciğer hastalığı olan hasta ile 45 KHAK’li hastanın tedavi öncesi serum VEGF düzeylerinin belirlenip 32 sağlıklı kontrolle karşılaştırıldığı bir çalışmada ise KHAK’li hastalarda serum VEGF düzeyleri anlamlı olarak yüksek bulunmuştur.[19]

Ayrıca, yaygın hastalıkta sınırlı hastalığa göre daha yüksek VEGF düzeyleri olduğu belirlenmiştir. Artmış serum VEGF düzeyi olan hastaların hem progresyonsuz yaşam sürelerinin, hem de sağkalımlarının VEGF düzeyi normal olan hastalardan daha kısa olduğu da gözlenmiş ve serum VEGF düzeylerinin küçük hücreli akciğer kanserinde kötü prognoz ile ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır.[17]

Yirmi dört küçük hücreli dışı, 13 küçük hücreli akciğer kanserli hastada ve 10 sağlıklı kontrolde serum VEGF ve VEGF-R1 düzeylerinin ELISA yöntemi ile belirlendiği bir çalışmada serum VEGF düzeyleri kontrollere göre yüksek bulunmuşken, VEGF-R1 düzeylerinde istatistiksel anlamlılık belirlenememiştir. Hastalığın histolojik tipine göre bakıldığında da istatistiksel anlamlılık yokken, çapı 7.5 cm’den büyük tümörlerde VEGF düzeyinin anlamlı olarak yüksek olduğu gözlenmiştir. Bu verilere göre VEGF, reseptörlerine göre klinikte kullanılması daha yararlı bir belirleyici olarak düşünülmüştür.[20] Bizim çalışmamızda ise hem VEGF hem de reseptörleri hastalarda kontrollere göre yüksek bulunmuştur.

Kırk dört küçük hücreli dışı, 36 küçük hücreli akciğer kanserli hastada VEGF-R2 düzeylerinin ELISA yöntemi ile belirlendiği bir çalışmada kemoterapi sonrası serum VEGF-R2 düzeyinin progresyon gösteren hastalarda kısmi remisyon gösteren hastalara göre daha yüksek olduğu, sağlıklı kontrollere göre her iki grubun da serum VEGF-R2 düzeyinin düşük olduğu gözlenmiştir. Bu sonuçlara göre kemoterapi sırasında serum VEGF-R2 düzeyinin yükselmesinin hastalığın progresyonuyla ilgili belirleyici olabileceği düşünülmüştür.[21] Ancak bizim çalışmamızda bu çalışmanın aksine VEGF-R2 düzeylerinde anlamlı bir değişiklik görülmemiştir.

Anjiogenez, aktivatör ve inhibitörlerin arasındaki dengeye bağlı olarak düzenlenmektedir. Tümör dokusu gibi hızla çoğalan hücre ortamında bu denge anjiogenez lehine bozulmaktadır. Bu noktada antianjiogenik ajanlar tedavi seçeneği olarak devreye girer (İbrahim Güllü’nün sunumundan değiştirerek yazdım, literatür bulamadım).

Antianjiogenik tedavinin tek başına veya sitotoksik tedavi ile birlikte uygulama çalışmaları devam etmektedir. Bazı deneysel çalışmalarda sitotoksik tedavi ile beraber uygulandığında tam yanıt sağladığı gözlemlenmiştir.[22,23]

Yüz iki KHAK hastasıyla yapılan randomize faz II çalışmasında bir anti-VEGF ajan olan bevacizumab’ın cisplatin veya carboplatin+etoposid ile birlikte verildiğinde progresyonsuz sağkalımı arttırdığı belirtilmiştir.[24]

Yedi yüz yirmi dört KHAK’li ve 722 KHDAK’li hastayla yapılan faz III çalışmada antianjiogenik etkinliği olduğu düşünülen thalidomid’in kemoterapiyle kombine verildiğinde KHAK’li ve KHDAK’li hastaların serum VEGF ve diğer anjiogenik faktör düzeylerinde yalnızca kemoterapi alan hastalara göre anlamlı bir değişiklik sağlamadığı gözlemlenmiştir.[25]

Başta bevacizumab olmak üzere diğer antianjiogenik ajanlar üzerinde birçok faz II ve faz III çalışma devam etmektedir. Çalışmaların bazılarının sonuçları hayal kırıklığı yaratsa da[26,27] bazı biyobelirteçler ve radyolojik teknikler gelecekte antianjiyogenik tedavilerin kullanımını yönlendirmek için yararlı olabilir.[28]

Çalışmamızda VEGF ve reseptörlerinin serum düzeylerinin ileri evre akciğer kanserli hastalarda yüksek düzeyde bulunması, kanser hücrelerinin proliferasyon ve migrasyonunda önemli olduğunu, özgüllük ve duyarlılıklarının yüksek olması, hastaya uygulanacak antianjiogenik tedavinin kararının verilmesinde kullanılabileceğini düşündürmektedir. Fakat bu parametreler kemoterapi ile değişiklik göstermediğinden tedavi takibinde faydalanılamayacak belirleyicilerdir.

References

1) Zetter BR. Angiogenesis and tumor metastasis. Annu Rev Med 1998;49:407-24.

2) Poon RT, Fan ST, Wong J. Clinical implications of circulating angiogenic factors in cancer patients. J Clin Oncol 2001;19(4):1207-25.

3) Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev 1997;18(1):4-25.

4) Ogawa S, Oku A, Sawano A, Yamaguchi S, Yazaki Y, Shibuya M. A novel type of vascular endothelial growth factor, VEGF-E (NZ-7 VEGF), preferentially utilizes KDR/Flk-1 receptor and carries a potent mitotic activity without heparin-binding domain. J Biol Chem 1998;273(47):31273-82.

5) Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: molecular and biological aspects. Curr Top Microbiol Immunol 1999;237:1-30.

6) Veikkola T, Karkkainen M, Claesson-Welsh L, Alitalo K. Regulation of angiogenesis via vascular endothelial growth factor receptors. Cancer Res 2000;60(2):203-12.

7) Rhee J, Hoff PM. Angiogenesis inhibitors in the treatment of cancer. Expert Opin Pharmacother 2005;6(10):1701-11.

8) Topuz E, Aydıner A. Akciğer kanseri. İçinde: Topuz E, Aydıner A, Karadeniz AN, editörler. Klinik onkoloji. İ.Ü. Onkoloji Enstitüsü Yayınları (06); 2000. s. 82-9.

9) Bossuyt PM, Reitsma JB, Bruns DE, Gatsonis CA, Glasziou PP, Irwig LM, et al. Towards complete and accurate reporting of studies of diagnostic accuracy: the STARD initiative. Fam Pract 2004;21(1):4-10.

10) Carmeliet P. VEGF as a key mediator of angiogenesis in cancer. Oncology 2005;69:4-10.

11) Mall JW, Schwenk W, Philipp AW, Meyer-Kipker C, Mall W, Muller J, et al. Serum vascular endothelial growth factor levels correlate better with tumour stage in small cell lung cancer than albumin, neuronspecific enolase or lactate dehydrogenase. Respirology 2002;7(2):99-102.

12) Salven P, Ruotsalainen T, Mattson K, Joensuu H. High pre-treatment serum level of vascular endothelial growth factor (VEGF) is associated with poor outcome in small-cell lung cancer. Int J Cancer 1998;79(2):144-6.

13) Ma PC, Blaszkowsky L, Bharti A, Ladanyi A, Kraeft SK, Bruno A, et al. Circulating tumor cells and serum tumor biomarkers in small cell lung cancer. Anticancer Res 2003;23(1A):49-62.

14) Takigawa N, Segawa Y, Fujimoto N, Hotta K, Eguchi K. Elevated vascular endothelial growth factor levels in sera of patients with lung cancer. Anticancer Res 1998;18(2B):1251-4.

15) Matsuyama W, Hashiguchi T, Mizoguchi A, Iwami F, Kawabata M, Arimura K, et al. Serum levels of vascular endothelial growth factor dependent on the stage progression of lung cancer. Chest 2000;118(4):948-51.

16) Lucchi M, Mussi A, Fontanini G, Faviana P, Ribechini A, Angeletti CA. Small cell lung carcinoma (SCLC): the angiogenic phenomenon. Eur J Cardiothorac Surg 2002;21(6):1105-10.

17) Hasegawa Y, Takanashi S, Okudera K, Kumagai M, Hayashi A, Morimoto T, et al. Vascular endothelial growth factor level as a prognostic determinant of small cell lung cancer in Japanese patients. Intern Med 2005;44(1):26-34.

18) Tanno S, Ohsaki Y, Nakanishi K, Toyoshima E, Kikuchi K. Human small cell lung cancer cells express functional VEGF receptors, VEGFR-2 and VEGFR-3. Lung Cancer 2004;46(1):11-9.

19) Kishiro I, Kato S, Fuse D, Yoshida T, Machida S, Kaneko N. Clinical significance of vascular endothelial growth factor in patients with primary lung cancer. Respirology 2002;7(2):93-8.

20) Swidzińska E, Ossolińska M, Naumnik W, Izycki T, Kucejko W, Chyczewska E. Circulating VEGF and its soluble receptor sVEGFR-1 in patients with lung cancer. [Article in Polish] Pneumonol Alergol Pol 2004;72(9-10):389-94. [Abstract]

21) Naumnik W, Izycki T, Swidzińska E, Ossolińiska M, Chyczewska E. Serum levels of VEGF-C, VEGF-D, and sVEGF-R2 in patients with lung cancer during chemotherapy. Oncol Res 2007;16(9):445-51.

22) O’Reilly MS, Boehm T, Shing Y, Fukai N, Vasios G, Lane WS, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997;88(2):277-85.

23) Holmgren L, O’Reilly MS, Folkman J. Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression. Nat Med 1995;1(2):149-53.

24) Spigel DR, Townley PM, Waterhouse DM, Fang L, Adiguzel I, Huang JE, et al. Randomized phase II study of bevacizumab in combination with chemotherapy in previously untreated extensive-stage small-cell lung cancer: results from the SALUTE trial. J Clin Oncol 2011;29(16):2215-22.

25) Young RJ, Tin AW, Brown NJ, Jitlal M, Lee SM, Woll PJ. Analysis of circulating angiogenic biomarkers from patients in two phase III trials in lung cancer of chemotherapy alone or chemotherapy and thalidomide. Br J Cancer 2012;106(6):1153-9.

26) Jalal S, Bedano P, Einhorn L, Bhatia S, Ansari R, Bechar N, et al. Paclitaxel plus bevacizumab in patients with chemosensitive relapsed small cell lung cancer: a safety, feasibility, and efficacy study from the Hoosier Oncology Group. J Thorac Oncol 2010;5(12):2008-11.

27) Ramalingam SS, Belani CP, Mack PC, Vokes EE, Longmate J, Govindan R, et al. Phase II study of Cediranib (AZD 2171), an inhibitor of the vascular endothelial growth factor receptor, for second-line therapy of small cell lung cancer (National Cancer Institute #7097). J Thorac Oncol 2010;5(8):1279-84.

28) Marco S, Tomasini P, Greillier L, Barlesi F. Anti-angiogenic factors in thoracic oncology: successes, failures and prospects. [Article in French] Rev Mal Respir 2011;28(10):1216-29.[Abstract]